FICHE TECHNIQUE DES TRAVAUX PRATIQUES EN MICROBIOLOGIEGENERALE
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Niveau |
2ième année |
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Filière |
Sciences Biologiques |
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Matière |
Microbiologie |
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Semestre |
4 |
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VH hebdomadaire |
3h (Cours) + 1h30 (TD) + 1h30 (TP) |
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Programme des Travaux Pratiques (Selon le Canevas) |
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1- Introduction au laboratoire de microbiologie 2- Méthodes d’étude des micro-organismes et les différents procédés de stérilisation 3- Méthodes d’ensemencement 4- Etude microscopique des bactéries, coloration simple 5- Etude morphologique des différentes colonies bactériennes sur milieu de culture 6- Coloration de Gram 7- Les milieux de culture 8- Etude de la croissance bactérienne 9- Critères d’identification biochimique des bactéries 10- Levures et cyanobactéries 11- Les inhibiteurs de la croissance, l’antibiogramme 12- Isolement de la flore totale et spécifique de certains produits (eau, lait, etc.). |
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Programme des Travaux Pratiques Modifié (d’après les enseignants de la matière) |
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1- Introduction au laboratoire de microbiologie 2- les différents procédés de stérilisation 3- Les milieux de culture (préparation) 4- Les techniques d’ensemencements 5- Etude morphologique des différentes colonies bactériennes sur milieu de culture (étude macro-morphologique) 6- Etude microscopique des bactéries, coloration simple (étude micro-morphologique) 7- Coloration de Gram 8- Les inhibiteurs de la croissance, l’antibiogramme (les antibiotiques : étude in vitro) 9- Isolement de la flore totale du sol (dénombrement)
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TP N° 1. INTRODUCTION A LA MICRIBIOLOGIE
I. Objectifs :
1. Acquérir les connaissances indispensables relatives au risques biologiques et notamment
celui lié à la manipulation des souches microbienne.
2. Se familiariser avec le laboratoire de microbiologie, son équipement et son fonctionnement
II- Définition : La microbiologie est l’étude des microorganismes (germes = microbes), c’est-à-dire les organismes vivants invisibles à l’œil nu et qui doivent être observés, examinés et étudiés sous le microscope.
1- Matériel utilisés en microbiologie:
1-1- Matériel léger:
- Le bec Bünsen : fonctionne avec une flamme bleue pour donner une haute température adéquate à la stérilisation des instruments. La zone de stérilité est sphérique (un diamètre de 10 à 15 cm). Toutes les manipulations doivent être à l’intérieur de cette sphère stérile.
- Les boîtes de Pétri: de 90 cm ou 60 mm de diamètre.
- Les tubes à essai: tubes en verre fermés avec bouchons métalliques. Ces tubes peuvent être bouchés au coton cardé (hydrophobe).
- La pipette Pasteur: tube fin en verre pour effectuer les prélèvements, les ensemencements (les inoculations), les repiquages des microorganismes en milieu liquide ou solide. Il faut stériliser les pipettes Pasteur avant et après chaque transport de germes.
- Le râteau (étaloir en verre ≈ une crosse de hockey !): pour étaler une suspension microbienne sur un milieu de culture solide.
- L’anse à ensemencer: un fil (en platine, en tungstène ou en nickel chrome) monté sur un porte-fil. Cette anse est utilisée pour les prélèvements, les ensemencements et les repiquages. Sa stérilisation est effectuée dans la flamme bleue du bec Bünsen avant et après chaque emploi.
1-2- La verrerie utilisée en microbiologie
Cette verrerie est utilisée pour préparer les milieux de culture et pour effectuer les fermentations. Elle est synthétisée en pyrex (verre chimiquement propre et stérilisable) : ballons, fioles (jaugées ou pas), éprouvette graduées, pipettes graduées, entonnoirs, béchers, Erlenmeyers, etc.
1-3- Le matériel lourd
- L’autoclave
- Le microscope.
- L’étuve (l’incubateur), la balance de précision, le chauffe-ballon, le réfrigérateur, le pH-mètre, l’agitateur magnétique, le bain-marie, etc.
III- La stérilisation : C’est le procède par lequel on obtient la destruction (l’éradication) totale des microorganismes (saprophytes ou pathogènes, et sous leur forme végétative ou sporulée). L’autoclave est la méthode la plus couramment utilisée.
III-1- L’autoclave et l’autoclavage: L’autoclave ressemble à une marmite (cocotte-minute) qui permet d’obtenir une température de 120 °C et une pression de 1 atm. (atmosphère). 1 atm = 1,013 bar = 14,7 Psi. L’autoclavage est une méthode de stérilisation la chaleur humide sous pression, c’est-à-dire avec la vapeur d’eau saturée sous pression. C’est une méthode rapide et efficace (détruit toutes les formes végétatives y compris les endospores), à condition que l’air soit complètement éliminé. L’autoclavage ne convient pas pour les produits alimentaires et pharmaceutiques, etc.
NB : les récipients (tubes à essai, flacons, bouteilles et autres) sont remplis aux ¾ des volumes totaux.
Tableau 1 : Les risques au laboratoire de microbiologie
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Matériel utilisé |
Nature du risque |
Geste sécurité - Prévention |
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Le bec bunsen |
Brulures |
Port d'une blouse non inflammable. Cheveux courts ou attachés. Vigilance. Ne pas approcher un produit inflammable |
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Verres (lame, pipette) |
Coupures |
Port de gants. Vigilance. |
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Pipettes Pasteur : - stériles - contaminées
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Piqures |
Les poser sur leur support. Ne pas laisser de fragments sur la paillasse. |
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Les jeter immédiatement après usage dans le bac de Javel. |
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Matériel électrique |
Electrocution |
Sols et paillasses secs. Ne pas toucher une prise ou une fiche d'appareil avec les mains mouillées. Signaler au professeur tout appareil abîmé (fil dénudé). |
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Produits chimiques |
Inhalation |
Maintenir les flacons fermés. Ne pas respirer au-dessus d'un flacon ouvert. |
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Ingestion |
Ne jamais prélever à la bouche. Utiliser une poire aspirante ou une pipette automatique. |
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Projections |
Utiliser une blouse, des gants, des lunettes et travailler sous hotte. |
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Combustion |
Ne pas manipuler les produits inflammables à proximité d'une flamme ou d'une source d'étincelles ou de chaleur. |
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Micro-organismes |
Inhalation |
Port de masque. Manipulation de souches dangereuses sous la hotte. |
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Ingestion |
Utilisation de poires aspirantes, de système d'aspiration Ne pas porter les mains à la bouche. |
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Projections |
Eviter les courants d'air. Flamber l'oese progressivement (boucle en dernier !!!) Ne pas porter de lentilles. |
TP N° 2. LES DIFFERENTS PROCEDES DE STERILISATION
I. Objectifs
* S'initier à la manipulation aseptique, à l’organisation du poste de travail et aux techniques de stérilisation
1. Définition
C'est le procédé par lequel on détruit ou on élimine d'un objet, des milieux inertes ou d'un lieu toutes les cellules vivantes, les spores viables et les virus, et ce de manière durable. Un objet stérile est totalement dépourvu de microorganismes et de spores, l'agent chimique ou physique qui permet la stérilisation est appelé agent stérilisant. En microbiologie, le but de la stérilisation est d'une part de maîtriser les micro-organismes introduits dans le milieu d'étude, et d'autre part d'éviter la contamination du milieu extérieur et des personnes.
1.1.La stérilisation par les méthodes physiques
Tableau 1.Les méthodes physiques de stérilisation
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Méthodes |
Efficacité |
Utilisation |
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Radiations
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- Rayons ultra-violets |
- Ne pénètre pas en profondeur des objets. |
- air et surfaces de travail, laboratoires, salle d’ensemencement, bloc opératoire, etc. |
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- Rayons X et gamma (γ) |
- Pénètre en profondeur des objets. |
- Produits pharmaceutiques et alimentaire, matière plastique, des pansements, des boites de Pétri, l’industrie de la mise en conserve, |
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Filtration (à travers des substances poreuses = filtres): la taille des pores est de 0,22 µm |
- Ne retient pas les virus |
- Solutions de substances thermosensibles = thermolabiles (altérés par la chaleur) comme certains milieux de culture, acides aminés, vitamines, hormones, antibiotiques, etc. |
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Chaleur sèche |
- Flambage par bec Bünsen (brûleur à gaz) |
Contact direct avec la flamme |
- Pour stériliser le matériel métalliques, en inox ou en verre : les pinces, les pipettes Pasteur, les anses à ensemencer (le fil), etc. |
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- Air chaud : four Pasteur |
- Une température de 180 °C pendent 1 h pour détruire les formes végétatives et également les spores |
- Pour stériliser le matériel métallique (les pinces, etc.), en inox, en porcelaine, ou en verre (les pipettes Pasteur, etc.). Elle ne convient pas pour les milieux de culture, les objets en plastique, en caoutchouc, |
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Chaleur humide |
- Ebullition (traitement par la vapeur) : 100 °C pendant 30 minutes |
- Détruit la plupart (mais pas la totalité) des bactéries, les champignons et les virus. N’est pas efficace contre les endospores. |
Equipement médical ou industriel thermorésistant, aiguilles, seringues, pinces, solution concentrée de sucres, gélatine, |
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- Pasteurisation : 90 °C pendant 30 seconds |
- Détruit tous les pathogènes, mais pas forcément toutes les bactéries. Elle ne détruit pas les endospores. |
- Protège les produits alimentaires (lait, jus, etc.) |
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- Tyndallisation : 3 traitements consécutifs de 60-90 °C pendant 1 h, à des intervalles de 24 h |
- Les formes végétatives sont détruites le 1er jour. Les endospores qui germinent, durant les intervalles à TA, sont détruites lors des traitements suivants. - A 60-90 °C, la germination des endospores est induite |
- Milieux non autoclavables (substances relativement thermosensibles et non filtrables) : vaccin, sérum, émulsion de jaune d’œuf, etc. |
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- Autoclavage : 120 °C pendant 20 minutes |
- Détruit toutes les cellules végétative et les endospores |
- Milieux de culture, le matériel métalliques, en inox, en caoutchouc, ou en verre : les pinces, les pipettes Pasteur, etc. |
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*La pasteurisation ancienne : 75 °C pendant 20 minutes (déjà abandonnée à l’échelle industrielle), puis refroidir brusquement à 5 °C.
1.2. La stérilisation par les méthodes chimiques
Propriétés et utilisation de quelques groupes de désinfectants et antiseptiques courants ;
1.Les composés phénoliques :
Phénol :
- 1er désinfectant et antiseptique largement utilisé
- Activité : Dénaturation des protéines et altération des membranes cellulaires
- Avantages : Actifs longtemps après leur application
- Inconvénients : Odeur désagréable
2. Les alcools : Parmi les désinfectants et les antiseptiques les plus utilisés
- Forme : Ethanol - Isopropanol à 70-80 %
- Activité : Dénaturation des protéines
3. Les halogènes :Iodophores : iode complexé à des transporteurs organiques
- Avantages : Solubles dans l'eau, non tachant, plutôt stable.
- Inconvénients : Brûlures et irritation de la peau réduite
- Utilisation : Antisepsie préopératoire de la peau, désinfectants (hôpitaux, labos)
- Exemples ; Bétadine et proviodine
4. Chlores : un des désinfectants les plus communs.
- Utilisation : Traitement des eaux
- désinfection de locaux Forme - Gaz (Cl2)
ØHypochlorite de calcium
ØHypochlorite de sodium
- Activité : Oxydation des constituants cellulaires
5. Eau oxygénée : agent oxydant (H2O2)
6.Les ammoniums quaternaires
- Savons : Pouvoir antiseptique variable ~ Agents mouillants
- Détergeant : Agents mouillants (tensioactifs)
Øanioniques : renforcent l'action d'autres désinfectants
Øcationiques = désinfectants + efficaces
- Activité : Déstructuration de la membrane plasmique
- Avantages : Stable, Incolores, inodores
- Utilisation : thérapeutique locale.
7. Les gaz stérilisants
- Utilisation : Produits ou objets instables à la chaleur et la désinfection de locaux
ØVapeurs de formaldéhyde
- Spectre d'action : pouvoir bactéricide puissant
- Inconvénients – Toxiques
ØOxyde d'éthylène
- Activité : Dénaturation des protéines
- Inconvénients : Très toxique
TP N° 3: LES MILIEUX DE CULTURE
Objectifs
1-Mettre en évidence les qualités d’un bon milieu de culture au détriment d’exigences
nutritionnelles et physico-chimiques des microorganismes.
2-Connaitre les différents types de milieux de culture utilisés en microbiologie.
3-S’initier avec les techniques de préparation des milieux de culture, leur stockage et
utilisation.
I- Introduction : les microbiologistes ont utilisé les milieux de culture pour isoler, purifier, repiquer, cultiver, conserver, étudier et identifier les germes (microorganismes). Ces milieux constitués à partir de composes biologiques et/ou chimiques reproduisant un environnement favorable à la croissance de certaines espèces microbiennes.
II- Définition : les milieux de culture sont des préparations gélosées (solides), semi-solides ou liquides utilisées pour faire croitre et étudier les microorganismes. Ils offrent sous forme assimilable toutes les substances indispensables à leur nutrition. A ce jour, plusieurs centaines de milieux de culture ont été décrits.
Un milieu contenant uniquement ce qui est nécessaire aux microorganismes (eau, source de carbone, source d’énergie, source d’azote et sels minéraux) est un milieu minimum.
III- Les différents types de milieux de cultures:
III-1- Selon leur consistance:
Elle peut être:
1- Liquide (bouillon): ne contenant pas d’agar agar (= agar = gélose).
2- Semi-solide : contenant entre 0,5 et 0,75 % (c’est-à-dire entre 50 et 75 g/L) d’agar agar.
3- Solide : contenant entre 1,5 et 2 % (c’est-à-dire entre 150 et 200 g/L) d’agar agar.
NB : dans un milieu liquide, les microorganismes se développent pour former un trouble, des dépôts, des agglomérats ou des voiles sur la surface. La croissance peut être mesurée par la turbidimétrie.
III-2- Selon leur composition:
1- Un milieu complexe est composé de substances nutritives naturelles (animales ou végétales) : la composition chimique de leurs ingrédients est indéterminée ou mal définie.
2- Un milieu synthétique (défini) est formé de substances nutritives chimiquement connus.
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Substances nutritives synthétiques (définis) |
Substances nutritives complexes (naturelles) |
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glucose, saccharose, glycérol, amidon, nitrate, sels minéraux, |
mélasses de canne à sucre, peptones, extrait de viande, extrait de levure, extrait de foie, |
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Ces milieux sont utilisés en physiologie bactérienne. |
Ex. le bouillon nutritif et la gélose nutritive, la gélose de Chapman, la gélose VF (viande-foie), le milieu Sabouraud (milieu gélosé glucosé), etc. |
* Peptone obtenue = hydrolysats (produits de dégradation, généralement des acides aminés) de protéines végétales ou animales (viande, caséine, soja, gélatine, etc.) = c’est une source de carbone, d’énergie et d’azote.
III-3- Selon leur utilisation:
1- Milieux usuels (de base) : la gélose nutritive pour les bactéries, le milieu Sabouraud pour les champignons = champignons filamenteux (moisissures) + levures.
2- Milieux d’isolement :
- Milieux d’enrichissement: la gélose en présence de la cellulose, pour cibler les bactéries cellulolytiques (bactéries appartiennent à des espèces différentes et genres différents).
- Milieux sélectifs: la gélose de Chapman (75 g/L de NaCl) pour isoler principalement les Staphylococcus, les Micrococcus, les Enterococcus et les Bacillus.
- Milieux différentiels: la gélose au sang pour isoler les Streptococcus.
3- Milieux d’identification : mannitol-mobilité, VF, etc.
4- Milieux de conservation : ce sont des milieux pauvres qui maintiennent les microorganismes dans un état de vie ralentie.
IV- La composition de quelques milieux de culture:
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Le bouillon nutritif (BN) (milieu de base, complexe, liquide) Extrait de viande : 5 g, Bacto-peptone : 10 g, NaCl : 5 g, Eau distillée : 1 L (pH : 7 à 7,5).
+ 20 g/L d’agar agar pour la gélose nutritive (GN). |
La gélose de Chapman (milieu gélosé complexe et sélectif) Peptone : 10 g, extrait de viande : 1 g, NaCl : 75 g, mannitol : 10 g, rouge de phénol : 0,025 g, agar agar : 15 g, Eau distillée : 1 L (pH : 7 à 7,5).
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La gélose VF (milieu gélosé, complexe pour déterminer le type respiratoire) Viande-foie : 30 g, glucose : 2 g, agar agar : 6 g, Eau distillée : 1 L (pH : 7 à 7,5). |
La gélose ISP2 (International Streptomyces Project) (milieu gélosé de base*, complexe) Extrait de levure : 4 g, extrait de malt : 4 g, glucose : 4 g, agar agar : 18 à 20 g, Eau distillée : 1 L (pH : 7 à 7,5). * Principalement pour les bactéries. |
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Le milieu Sabouraud (milieu gélosé de base*, complexe) Glucose : 20 g, peptone : 10 g, agar agar : 20 g, Eau distillée : 1 L (pH : 6 à 6,5). * Principalement pour les champignons. |
Le bouillon Citrate Simmons (milieu synthétique solide) Citrate de sodium : 1 g, MgSO4 : 0,2 g, (NH4)2HPO4 : 1 g, KH2PO4 : 1 g, NaCl : 5 g, Bleu de bromothymol: 0,08 g, agar agar : 15 g, Eau distillée : 1 L (pH : 7 à 7,5). |
Matériel et produits chimiques utilisés
- Matériel léger:
- Les becs Bünsen.
- L’anse à ensemencer.
- Les boîtes de Pétri: de 90 cm ou 60 mm de diamètre.
- Les tubes à essai (à vis).
- coton cardé.
- Les pipettes Pasteur.
- La verrerie:
- Eprouvette graduées de 500 mL, flacons de 500 mL et de 1000 mL, pipettes graduées, entonnoirs, béchers (1L), Erlenmeyers de 500 et de 1000 mL.
- Le matériel lourd
- L’autoclave.
- Les microscopes.
- L’étuve (l’incubateur).
- la balance de précision.
- Le pH-mètre.
- L’agitateur magnétique.
- Barreaux magnétique.
* La gélose nutritive (GN):
- Extrait de viande : 5 g,
- Bacto-peptone : 10 g,
- NaCl: 5 g,
- Agar agar : 20 g,
- Eau distillée : 1 L (pH : 7 à 7,5).
* La gélose ISP2 (International Streptomyces Project):
- Extrait de levure : 4 g,
- Extrait de malt : 4 g,
- Glucose : 4 g,
- Agar agar : 20 g,
- Eau distillée : 1 L (pH : 7 à 7,5).
- NaOH ou KOH (1N et 2N),
IV- Protocole expérimentale (Préparation d’un milieu de culture):
S’effectue par simple dissolution des ingrédients du milieu de culture dans un solvant (l’eau), et les différentes étapes de préparer un milieu de culture sont:
- la pesée, la dissolution des ingrédients (les ingrédients sont dissous dans un volume bien déterminé d’eau distillée), puis la solution portée ensuite à un volume final (q.s.p. = quantité suffisante pour Vf), la mesure et l’ajustement du pH (par l’ajout de quelques gouttes de NaOH ou KOH pour basifier le milieu ou HCl pour acidifier le milieu), La préparation d’un milieu de culture doit être sous agitation faible pour l’homogénéisation du milieu. Finalement, l’ajout de l’agar agar (s’il s’agit d’un milieu solide) dans les récipients, et la stérilisation est effectuée à l’autoclave à 120 °C pendant 20 minutes.
Remarques:
- Avant d’ajouter l’agar agar (pour les milieux solides) selon le volume final de chaque récipient, il faut d’abord ajuster le pH et distribuer le milieu dans les flacons, les tubes, les Erlenmeyers, etc.
- Si certains ingrédients du milieu peuvent être altérés par la chaleur, ils sont stérilisés séparément et ajoutés après autoclavage (dans des conditions stériles = d’asepsie). C’est le cas des sucres (sources de carbone) avec les protéines (source d’azote) qui peuvent réagir à la température de l’autoclavage (réaction de Maillard) ce qui provoque un brunissement du milieu de culture, donc on stérilise les sucres séparément (surtout les grandes quantités).
- Pour l’autoclavage, les tubes et les flacons sont fermés, mais le vis ou le bouchon ne soit pas trop serré. Et on visse les tubes et les flacons après autoclavage et refroidissement complet du milieu. Selon le besoin, les tubes sont mis à refroidir en position verticale (gélose en culot) ou en position inclinée (gélose en pente).
- Les boites de Pétri sont coulées immédiatement sous une hotte à flux laminaire ou a cote d’un bec Bünsen.
- Une hotte à flux laminaire est une hotte conçue pour éviter les contaminations. L'air passe à travers un filtre, puis est diffusé en un flux laminaire vers l'utilisateur.
Ces hottes sont généralement équipées d'une lampe UV à effet germicide pour stériliser le plan de travail et son contenu lorsqu'il n'est pas utilisé. Il est important d'éteindre cette lampe lorsqu'on travaille sous la hotte car elle brûlera rapidement toute surface exposée de peau.
- Apres l’autoclavage, il faut verser le milieu de culture à l’état fondu en surfusion (45 à 50 °C).
- Toujours, on retourne les boîtes de Pétri pour empêcher l’eau de condensation accumulée sous le couvercle de retomber sur la surface du milieu de culture. Leur stockage (dans un réfrigérateur) ou leur incubation (dans une étuve) se fait également dans cette position.
TP N° 4: LES TECHNIQUES D’ENSEMENCEMENT
I- Objectifs.
1. Connaitre les différentes techniques d’ensemencement
2. Ensemencer un bouillon ou une gélose nutritive par plusieurs méthodes de manièreaseptique
II- Définitions :
- L’encensement : consiste à déposer dans un milieu de culture stérile des microorganismes prélevés à partir d’une culture mère naturelle (eau, sol, etc.) ou culture pure. Le transfert est effectué en général avec un fil a ensemencer, a l’anse d’ensemencement ou la pipette pasteur.
- Le repiquage : la transplantation d’une culture pur sur un milieu de culture neuf.
- Le beurrage : l’ensemencement massif en stries très serrées a la surface d’un milieu solide dans le but d’obtenir une culture abondante.
- la semence microbienne = un inoculum → inocula.
- Il faut toujours flamber légèrement l’orifice (l’ouverture) du tube.
- A la fin de la manipulation, la place de travail est désinfectée à l’eau de Javel (ou à l’alcool) et les pipettes Pasteur sont flambées, puis placées dans un bac à désinfectant.
III- Matériel utilisés
- Milieux de culture solide dans les boîtes de Pétri.
- Des tubes contenant des milieux deculture
- Les becsBünsen.
- L’anse à ensemencer.
- Pinces métalliques.
- Les pipettes Pasteur.
IV- Les techniques d’ensemencement :
IV-1- Ensemencement par stries ou par épuisement sur gélose (trois ou quatre secteurs/cadrans)
IV-2- Ensemencement sur milieu solidifié incliné en tubes à essai: on essuie soigneusement le fil ou la boucle de l’anse ou la tête de pipette Pasteur chargée de microorganismes sur la surface inclinée (pente gélosée), depuis la partie la plus basse jusqu’à la partie la plus élevée, en réalisant des stries très serrées en zigzag, come comme l’ensemencement des milieux de culture utilisés pour étudier le métabolisme bactérien.
IV-3- Ensemencement en touche (en spots)
IV-4- Ensemencement par piqure centrale profonde : se fait dans un milieu de culture en culot à partir d’une culture en milieu liquide ou solide. On introduit le fil à ensemencer ou la tête de la pipette Pasteur chargée d’inoculum, verticalement au milieu, comme l’ensemencement du milieu mannitol-mobilité.
IV-5- Ensemencement en spirale : se fait dans un milieu de culture en culot à partir d’une culture en milieu liquide ou solide. On introduit le fil à ensemencer ou la tête de la pipette Pasteur chargée d’inoculum, d’une manière spiralée au milieu depuis la partie la plus basse jusqu’à la partie la plus élevée, en réalisant des spirales, comme l’ensemencement du milieu VF.
IV-6- Ensemencement dans un milieu liquide (par agitation)
1- Ensemencement d’un bouillon nutritif
Procédure suivie
1. Flamber l'anse de platine.
2. Ouvrez le tube de la suspension bactérienne et flamber son ouverture.
3. Plonger la boucle dans la suspension bactérienne, puis retirez-la.
4. Flamber de nouveau l'ouverture du tube et remettre le bouchon du tube de culture.
5. Ouvrir le tube de bouillon nutritif et flamber son ouverture.
6. Inoculer la boucle dans le tube de bouillon.
7. Flamber le tube après inoculation puis remettre le bouchon.
8. Flamber la boucle et la poser sur la paillasse.
2- Ensemencement par stries d'épuisement
C’est le type de base des ensemencements. En effet, il permet s’il est bien réalisé, d’obtenir des
colonies isolées, donc d’obtenir des cultures pures d’une espèce bactérienne.
Le principe de
ce type d’ensemencement est d’épuiser un dépôt initial en faisant des étalements
successifs dans différentes directions (d’où le nom de la technique : épuisement).
Après avoir prélevé aseptiquement un échantillon
(près du bec Bunsen, avec une anse stérile)
1. Effectuer une striation continue (gauche) ou une série
de 4 stries (droite) en évitant de passer deux fois au
même endroit. Refermer.
Flamber l’anse.
2. Effectuer une 2e striation continue (gauche) en ne
passant que 2 fois dans la 1ère strie; ou une 2e série de 4
stries (droite) en évitant de passer deux fois au même
endroit. Refermer.
Flamber l’anse.
3. Effectuer une 3e striation continue (gauche) en ne
passant que 2 fois dans la 2e strie; ou une 3e série de 4
stries (droite) en évitant de passer deux fois au même
endroit. Refermer.
Flamber l’anse.
4. Effectuer une 4e striation continue (gauche) en ne
passant que 2 fois dans la 3e strie; ou une 4e série de 4
stries (droite) en évitant de passer deux fois au même
endroit. Incuber.
3- Ensemencement d’un tube incliné
Cet ensemencement est utilisé pour fournir une croissance pure d'une culture bactérienne
Procédure suivie
1. Flamber l'anse de platine.
2. Ouvrez le tube de la suspension bactérienne et flamber son ouverture.
3. Plonger la boucle dans la suspension bactérienne (tube 1), puis retirez-la.
4. Flamber de nouveau l'ouverture du tube et remettre le bouchon du tube de culture.
5. Ouvrir le tube incliné (2) et flamber son ouverture.
6. Ensemencer le tube 2 par stries ascendantes.
7. Flamber le tube 2 après puis remettre le bouchon.
8. Flamber la boucle et la poser sur la paillasse.
4- Ensemencement d’un tube en culot
1. Flamber le fil droit.
2. Ouvrez le tube de la suspension bactérienne et flamber son ouverture.
3. Plonger le fil droit dans la suspension bactérienne (tube 1), puis retirez-le.
4. Flamber de nouveau l'ouverture du tube et remettre le bouchon du tube de culture.
5. Ouvrir le tube en culot (2) et flamber son ouverture.
6. Ensemencer le tube 2 par piqure centrale.
7. Flamber le tube 2 après puis remettre le bouchon.
8. Flamber le fil droit et le poser sur la paillasse.
5- Ensemencement à partir d’une série de dilutions décimales
On réalise une série de dilutions à partir de la solution mère (échantillon ou prélèvement)dans le but de réduire le nombre de la population microbienne dans chaque tube, on prélève de chaque dilution un volume adéquat qu’on ensemencera soit par étalement sur la gélose via un étaloir soit en procédant par un ensemencement dans la masse. Après incubation on obtient des colonies bien isolées et facilement repérables et facilement dénombrables.
TP N° 5: ETUDE MORPHOLOGIQUE DES DIFFERENTES COLONIES BACTERIENNES SUR MILIEU DE CULTURE
I- Objectifs
- Etude de l'aspect des colonies sur un milieu solide (en général) et même sur un milieu liquide.
- Différentiation entre les colonies des bactéries et les colonies des champignons
II- Définition
Une colonie est l'amas, visible à l’œil nu, constitué par des milliards de descendants d'une seule cellule bactérienne et dont la taille, la forme, la couleur, la consistance sont caractéristiques de chaque espèce (parfois, même de chaque souche de la même espèce).
- Sur un milieu solide: pour déterminer les formes des colonies, leurs couleurs, leurs pigments, diffusibles ou non, etc.
- Sur un milieu liquide: pour déterminer si la culture est trouble ou limpide, homogène ou hétérogène, la croissance sous forme de surnageant sur le milieu ou précipité en bas du milieu, ou les deux, etc.
La description des colonies doit mentionner:
III- La description d’une colonie isolée se faite grâce aux critères suivants:
1- La taille ou le diamètre de la colonie: elle peut être mesurée à l'aide d'une règle graduée.
2- La forme
a) punctiforme, b) circulaire, c) ondulée, d) lobée, e) érodée, f) filamenteuse, g) rhizoïde, h) plissée à striation radiale, i) plissé à striation concentrique.
3- Le relief
Surface bombée, demi-bombée, plate, centre parfois surélevé, parfois ombiliqué (en creux).
4- L'aspect de la surface:
- colonies S (Smooth = Lisse): colonies à surface lisse, de consistance crémeuse et donnant des suspensions homogènes.
- colonies R (Rough = Rugueux): colonies à surface rugueuse, de consistance sèche et donnant des suspensions hétérogènes.
5- La consistance on prélève la colonie à l’oëse, et on regarde comment elle se décolle de la gélose. Si elle adhère bien à l’oëse et vient facilement : elle est crémeuse ; si elle colle à l’oëse, fait des fils : elle est filante ou visqueuse, si on doit gratter la gélose pour la détacher, elle est sèche.
6- L'opacité: Les colonies sont décrites comme
- opaques (ne laissent pas passer la lumière).
- translucides (laissent passer la lumière mais on ne voit pas les formes au travers).
- transparentes (laissent passer la lumière et voir les formes au travers).
7- La couleur (pigmentation): est due à des pigments: jaune, rouge, orange, violette, etc
8- L’odeur: moisis, terreux (géosmine), etc.
IV- Matériel utilisés
Boites de Petride gélose nutritive contaminées préalablement par des microorganismes du laboratoire
Compteur de colonies
Règle graduée
Les becsBünsen.
L’anse à ensemencer
V- Protocole expérimentale
1- Déterminer le nombre des colonies dans chaque boite de Petri à l’aide d’un compteur de colonies
2- Mesurer les diamètres des colonies à l’aide d’une règle graduée
3- Déterminer la consistance des colonies en utilisant l’anse à ensemencer
VI- Observation des boîtes de gélose nutritive contaminée
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Type de contamination |
Observation des colonies |
Nombre de colonies si inférieur à 30 sinon notez + 30 |
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Air du labo |
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Air de la bouche |
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Empreinte |
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Cheveu |
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Eau de robinet |
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TP N° 6 : ETUDE MICROSCOPIQUE DES BACTERIES, COLORATION SIMPLE (ETUDE MICRO-MORPHOLOGIQUE)
I- Objectifs.
Etude de l'aspect microscopique des cellules bactériennes sous microscope optique
Différenciation entre le mouvement Browniens et le mouvementdes cellules bactériennes
II- Observation microscopique des colonies
- Microscope optique (photonique): permet l’observation de cellules vivantes ou mortes. Le grossissement total est le produit du grossissement de l’objectif multiplié par le grossissement de l’oculaire.
- L’examen à l'état frais (examen entre lame et lamelle des bactéries vivantes).
- L'examen après coloration (sur frottis séchés et fixés, et donc pour les bactéries mortes).
III- La description des cellules
1- La forme
Ce caractère est très important en bactériologie, il peut à lui seul conduire à la détermination de genre:
- une forme sphérique = coque = coccus → cocci (ordres de Micrococcales).
- une forme allongée en bâtonnet = bacille (cylindrique): les bacilles (ordre des Bacillales).
- une forme intermédiaire: les cocobacilles.
- une forme incurvée en virgule (Vibrio) ou en ondulation (ordre des Spirillales).
- une forme spiralée = hélicoïdale (ordre des spirochètes = spirochaetes = Spirochaetales).
- une forme filamenteuse ramifiée (ordre des actinobactéries = Actinobacteriales).
2- Mode de groupement : très utile pour identifier les genres: en chainette, grappe de raisin, ..
3- Mobilité: La mobilité est le caractère le plus important mis en évidence à l'état frais.
III- Matériel et produits chimiques utilisés
- Des lames et lamelles
- Microscopes
- Bleu de méthylène
- Pissettes d’eau
-Les becsBünsen.
IV- Protocole expérimentale
1- Prendre aseptiquement des prélèvements à partir des suspensions des souches bactériennes X1, X2 et X3 et les mettre entre lames et lamelles
2- Examiner les cellules sous microscope aux agrandissements x10, x40 et x100
3- Déterminer s’il existe le mouvement des cellules
4- Déterminer la forme des cellules et le mode de regroupement de chaque souche bactérienne
Tableau 1. Caractéristiques microscopiques des souches X1, X2 et X3
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Souche X1 |
Souche X2 |
Souche X3 |
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Forme des cellules |
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Taille des cellules |
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Mode de regroupement |
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Mouvement |
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TP N° 7 :COLORATION DE GRAM
I- Définition :
C’est une coloration double, et une coloration différentielle, elle permet de cataloguer les bactéries en deux grands groupes distincts (Gram-positives et Gram-négative). Cette coloration est développée en 1884 par le médecin Danois Christian Gram.
II- Principe :
Cette technique repose sur les caractéristiques de la paroi bactérienne (la différence de composition chimique entre les G+ et les G-, et donc la différence de perméabilité de la paroi a l’alcool).
III- Les produits chimiques (les réactifs utilisés) :
- Le violet de gentiane (colorant primaire):
- Violet de gentiane : 1 g.
- Ethanol absolu : 10 mL.
- Eau phénique (phénol à 1 % dans l’eau) : 90 mL.
- Le lugol (mordant):
- Iode (I2): 1 g.
- Iodure de potassium (KI): 2 g.
- Eau distillée : 300 mL.
- L’alcool (agent de décoloration):
- Ethanol.
- La fuchsine (colorant de contraste):
- Solution de fuchsine saturée a l’alcool : 10 mL.
- Eau distillée : 90 mL.
NB. Cette quantité est suffisante pour au moins 10 groupes.
Appareillages (matériel lourd) utilisés
IV- Appareillages (matériel lourd) utilisés :
- Autoclave
- Balance de précision
- L’étuve (l’incubateur)
- Microscope optique (un pour chaque 3 à 4 étudiants).
V- Matériel léger utilisés :
- Bec Bünsen (un pour chaque 3 à 4 étudiants).
- Boîtes de Pétri: de 90 cm de diamètre (2 boîtes de chaque type de bactéries / et pour chaque 3 à 4 étudiants).
- Pipettes Pasteur (2 pipettes pour chaque 3 à 4 étudiants).
- L’anse à ensemencer.
- Bacs ou petites cuvettes en verre (ou même des bechers).
- Picette (pour l’éthanol).
- Pinces métalliques.
· Lame et lamelle.
VI-Le protocole expérimental:
- Préparer la lame (un frottis): étalement (pour former une couche mince régulière), puis séchage (au-dessus de la flamme) ≡ la fixation (à ne pas carboniser le frottis).
- Coloration primaire : couvrir la lame avec le VG, et laisser agir 2 minutes. Puis, jeter l’excès de colorant.
- Mordançage : rincer et faire deux bains de lugol dans chacun dure 45 secondes (× 2).
- Décoloration : plonger la lame dans l’alcool durant 30 secondes exactement.
- Arrêter la différenciation par un lavage doux et abondant a l’eau distillée.
- Coloration secondaire : plonger la lame dans la fuchsine durant 2 minutes.
- Laver a l’eau distillée,
- Sécher la lame au-dessus de la flamme.
- Utiliser le plus petit objectif, puis graduellement observer à l’objectif a immersion
VII- Mode opératoire :
Après la fixation des bactéries par passage de la lame autour de la flamme du bec Bunsen,
- La lame est recouverte d’un premier colorant : le violet de gentiane = VG (ou d’un colorant proche le cristal violet). Le VG qui est un colorant puissant va traverser les parois vers l’intérieur de la bactérie (pseudo-cytoplasme). Les cellules de toutes les bactéries sont colorées en violet,
- La lame est ensuite traitée par une solution du lugol (un mordant), qui va se lier avec le VG : I≡VG.
- La lame après un rapide rinçage, est plongée dans un deuxième colorant, la fuchsine (ou la safranine). Ce colorant travers toutes les parois pour colorer en rose le pseudo-cytoplasme de toutes les bactéries qui ont été décolorées durant l’étape précédente (l’utilisation de l’alcool).
- Ensuite, on élimine le VG avec une solution d’alcool. Cette étape est très importante pour distinguer entre les bactéries à Gram positif et les bactéries à Gram négatif.
- La lame est récupérée, rincée et séchée, puis observée sous le microscope optique en utilisant le plus petit objectif, puis à l’objectif X100 (10 × 10), avec l’huile a immersion.
- Les bactéries Gram-positives restent toujours colorées en violet, et les bactéries Gram-négatives apparaîtront en rose.
VIII- Précautions et mesures de sécurité à prendre :
- Les étudiants doivent se munir d'une blouse (en coton).
- Il est impératif de travailler dans la sphère de stérilité d'un bec Bunsen, sans parler et en évitant les courants d'air.
- Les étudiants doivent respecter la discipline générale de travail (dans la salle de travaux pratiques de Microbiologie), même si les bactéries étudiées au cours des travaux pratiques ne présentent pas un danger majeur.
Après les manipulations il convient de nettoyer soigneusement les paillasses et de les désinfecter avec de
l'eau de Javel (pour éviter la contamination).
- Il faut faire très attention aux bouteilles de gaz et les éloigner de toute source de chaleur ou de projections de produits corrosifs.
TP N° 8: LES INHIBITEURS DE LA CROISSANCE (L’ANTIBIOGRAMME)
I- Objectifs
1- Connaitre la notion de l’antibiogramme et son intérêt
2- Connaitre les notions des CMI,CMB
3- Réaliser un antibiogramme standard (méthode de diffusion) in vitro
II- Définition
L’antibiogramme est un examen de laboratoire visant à déterminer la sensibilité d’une bactérie à différents antibiotiques.
Deux notions sont à connaître avant de faire un antibiogramme :
- La CMI ou Concentration Minimale Inhibitrice. Il s’agit de la concentration de l’antibiotique la plus faible pour laquelle la croissance bactérienne est inhibée (pas de croissance de la population ; 100% de survivants)
- La CMB ou Concentration Minimale Bactéricide. C’est la concentration de l’antibiotique la plus faible permettant de détruire 99.99% des bactéries présentes au départ (soit une bactérie survivante sur 10000). Si CMB < 5 CMI l’antibiotique est très efficace.
Au contraire si CMB > 10 CMI, on le considère peu efficace.
III- Principe général
Pour réaliser l’antibiogramme par le méthode des disques, la culture bactérienne est ensemencée à la surface d’une gélose spécialement étudiée, la gélose de Mueller-Hinton, éventuellement additionnée de sang. Des disques pré-imprégnés d’une dose connue d’antibiotique sont déposés à la surface de la gélose. L’antibiotique diffuse à partir du disque en créant un gradient de concentration. La détermination du diamètre de la zone d’inhibition permet une estimation de la concentration minimale inhibitrice. Les caractères de sensibilité ou de résistance de la souche bactérienne en seront déduits.
IV- Matériel utilisés
- Boites de Pétri
- Une suspension bactérienne
- Désinfectant
- Bec Bunsen
- Des pinces stériles
- Pipettes graduées, pro-pipettes
- Râteaux
- Disques d’antibiotiques à tester (la pénicilline G,l'ampicilline,Tétracycline,l'Acide Nalidixique)
V- Protocole expérimentale
Nettoyer la paillasse avec le désinfectant afin de minimiser les risques de contamination extérieur lors de la manipulation.
Allumer le bec Bunsen afin de stériliser l'air alentour et détruire ainsi les organismes pouvant altérer les résultats. Toute la manipulation doit se faire dans un rayon de 20/25 cm autour de la flamme.
Verser dans chaque boite de pétri 100µl de suspension bactérienne d'E. Coli, soit environ 3 gouttes, puis étaler la suspension sur toute la surface de la gélose afin d'obtenir une quantité la plus homogène possible de bactéries à la surface.
Laisser sécher la suspension pendant environ 20'.
A l'aide d'une pince stérile, prélever un disque antibiotique et le déposer au centre d'une boite de pétri, puis l'appuyer légèrement pour l'enfoncer dans la gélose. Renouveler l'opération pour les 4 antibiotiques, en prenant soin de changer de pinces à chaque nouvel antibiotique.
Placer les Antibiogrammes dans une étuve pendant 24h, le temps que la bactérie E. Coli se développe.
Observer les résultats.
Mesurer les zones d’inhibition
VI- Standardisation
La fiabilité des résultats d'un antibiogramme est influencée par de nombreux paramètres qui doivent être rigoureusement contrôlés. La standardisation est régie par des documents émanant de l'O.M.S. et des divers comités nationaux (pour la France, le Comité de l'Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie). Selon les pays, il peut exister des variations techniques et il est important de respecter une technique identique à celle utilisée pour l'établissement des courbes de concordance
Parmi les principales recommandations, on peut citer les points suivants :
- Le milieu de culture doit permettre la croissance de nombreuses bactéries et il ne doit pas contenir d'inhibiteurs des antibiotiques. Le milieu retenu pour la majorité des espèces bactériennes est celui de Mueller-Hinton.
Le pH influence l'activité de plusieurs antibiotiques (les aminosides et les macrolides sont plus actifs en milieu alcalin, alors que les tétracyclines sont plus actives en milieu acide) et il doit être compris entre 7,2 et 7,4 (valeur qui permet une bonne croissance bactérienne et qui réalise un compromis pour l'activité des antibiotiques).
L'épaisseur de la gélose va donc conditionner la concentration de la source d'antibiotique et elle doit être de 4 mm.
Les antibiotiques, ainsi que les disques doivent être standardisés. Cette standardisation est effectuée par les fabricants et le laboratoire a pour unique responsabilité de stocker les disques dans des conditions optimales et de ne pas utiliser des disques périmés. Avant utilisation, les disques doivent être amenés à température ambiante. Toute cartouche ouverte doit être utilisée dans les cinq jours.
La densité de l'inoculum bactérien est un élément primordial et elle doit être ajustée à l'aide d'un photomètre ou par comparaison avec un étalon d'opacité (échelle de McFarland).
Une phase de pré-diffusion des antibiotiques peut conduire à l'obtention de zones d'inhibition plus importantes. Selon les pays, une pré-diffusion est ou non préconisée. En France, la technique du "Comité de l'Antibiogramme de la SFM" ne prévoit pas de pré- diffusion
La température et la durée d'incubation doivent être fixes. Pour la majorité des bactéries l'incubation est effectuée à 35-37 °C durant 18-24 heures dans une atmosphère normale
La technique doit être régulièrement contrôlée avec des souches de référence
TP N° 9 :ISOLEMENT DE LA FLORE TOTALE DU SOL (DENOMBREMENT)
I- Objectifs
Isoler et dénombrer des microorganismes qui se trouvent dans un échantillon de sol par la méthode des dilutions tout en maintenant le plan de travail aseptique.
II- Echantillonage
Afin de déterminer la flore présente dans le sol, nous allons prélever de façon le plus stérilementpossible, un échantillon de terre afin de limiter l’apport d’autres contaminants.
III- Matériel utilisés
Boites de pétri contenant le milieu gélose nutritive
Tubes à essayecontenet
Micropipette de 1 ml
Embouts bleus et jaunes stériles
Pipettes Pasteur (râteau)
Portoir pour tubes.
Balance de précision
Etuve
IV- Protocole expérimentale
1 g de sol est pesé puis introduit dans un tube à essai contenant 9 ml de l'eau physiologique préalablement autoclavée. Le tube est ensuite agité énergiquement pendant 2 minutes. Le contenu du tube représente la solution mère.
Une série de dilution variant de 10-1 à 10-9est préparée. Le dénombrement après culture concerneévidement les cellules viables de l'échantillon.
Un volume de 0,1 ml est prélevé à l’aide d’une micropipette avec un embout stérile, puis déposé au centre de la gélose préalablement fondu est réparti dans des boites. Ce volume étalé à l’aide d’une pipette râteau sur toute la surface de gélose. Les boites de pétri sont mises dans l’étuve à 30 °C.
Après 24h à 48h d'incubation à 30°C, les colonies développées sont dénombrées à l'aide d'un compteur de colonies.
V- Dénombrement
il faut considérer que chaque colonieou clone visible correspond à un microorganisme déposé sur la boîte lors de l’étalement. Vue quecertaines colonies provenant de plusieurs cellules juxtaposées ou a partir des spores, on ne peut considérer que chaque cloneprovient d’une seule cellule originelle. On utilise donc le terme d’UFC (unité formant colonie) pourrapporter le résultat obtenu.
Le nombre de germes par gramme de sol est déterminé en calculant la moyenne arithmétique et en tenant compte des facteurs de dilution, selon la formule
N = n / d . v
N : nombre des microorganismes en UFC/ ml.
n: nombre des colonies dénombrées. seules les boîtescontenantentre 30et 300colonies serontprises en comptes
v: Volume prélevé (0.1ml).
d: Dilution.
- معلم: dif guendouz