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TP N° 8: LES INHIBITEURS DE LA CROISSANCE (L’ANTIBIOGRAMME)
I- Objectifs
1- Connaitre la notion de l’antibiogramme et son intérêt
2- Connaitre les notions des CMI,CMB
3- Réaliser un antibiogramme standard (méthode de diffusion) in vitro
II- Définition
L’antibiogramme est un examen de laboratoire visant à déterminer la sensibilité d’une bactérie à différents antibiotiques.
Deux notions sont à connaître avant de faire un antibiogramme :
- La CMI ou Concentration Minimale Inhibitrice. Il s’agit de la concentration de l’antibiotique la plus faible pour laquelle la croissance bactérienne est inhibée (pas de croissance de la population ; 100% de survivants)
- La CMB ou Concentration Minimale Bactéricide. C’est la concentration de l’antibiotique la plus faible permettant de détruire 99.99% des bactéries présentes au départ (soit une bactérie survivante sur 10000). Si CMB < 5 CMI l’antibiotique est très efficace.
Au contraire si CMB > 10 CMI, on le considère peu efficace.
III- Principe général
Pour réaliser l’antibiogramme par le méthode des disques, la culture bactérienne est ensemencée à la surface d’une gélose spécialement étudiée, la gélose de Mueller-Hinton, éventuellement additionnée de sang. Des disques pré-imprégnés d’une dose connue d’antibiotique sont déposés à la surface de la gélose. L’antibiotique diffuse à partir du disque en créant un gradient de concentration. La détermination du diamètre de la zone d’inhibition permet une estimation de la concentration minimale inhibitrice. Les caractères de sensibilité ou de résistance de la souche bactérienne en seront déduits.
IV- Matériel utilisés
- Boites de Pétri
- Une suspension bactérienne
- Désinfectant
- Bec Bunsen
- Des pinces stériles
- Pipettes graduées, pro-pipettes
- Râteaux
- Disques d’antibiotiques à tester (la pénicilline G,l'ampicilline,Tétracycline,l'Acide Nalidixique)
V- Protocole expérimentale
Nettoyer la paillasse avec le désinfectant afin de minimiser les risques de contamination extérieur lors de la manipulation.
Allumer le bec Bunsen afin de stériliser l'air alentour et détruire ainsi les organismes pouvant altérer les résultats. Toute la manipulation doit se faire dans un rayon de 20/25 cm autour de la flamme.
Verser dans chaque boite de pétri 100µl de suspension bactérienne d'E. Coli, soit environ 3 gouttes, puis étaler la suspension sur toute la surface de la gélose afin d'obtenir une quantité la plus homogène possible de bactéries à la surface.
Laisser sécher la suspension pendant environ 20'.
A l'aide d'une pince stérile, prélever un disque antibiotique et le déposer au centre d'une boite de pétri, puis l'appuyer légèrement pour l'enfoncer dans la gélose. Renouveler l'opération pour les 4 antibiotiques, en prenant soin de changer de pinces à chaque nouvel antibiotique.
Placer les Antibiogrammes dans une étuve pendant 24h, le temps que la bactérie E. Coli se développe.
Observer les résultats.
Mesurer les zones d’inhibition
VI- Standardisation
La fiabilité des résultats d'un antibiogramme est influencée par de nombreux paramètres qui doivent être rigoureusement contrôlés. La standardisation est régie par des documents émanant de l'O.M.S. et des divers comités nationaux (pour la France, le Comité de l'Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie). Selon les pays, il peut exister des variations techniques et il est important de respecter une technique identique à celle utilisée pour l'établissement des courbes de concordance
Parmi les principales recommandations, on peut citer les points suivants :
- Le milieu de culture doit permettre la croissance de nombreuses bactéries et il ne doit pas contenir d'inhibiteurs des antibiotiques. Le milieu retenu pour la majorité des espèces bactériennes est celui de Mueller-Hinton.
Le pH influence l'activité de plusieurs antibiotiques (les aminosides et les macrolides sont plus actifs en milieu alcalin, alors que les tétracyclines sont plus actives en milieu acide) et il doit être compris entre 7,2 et 7,4 (valeur qui permet une bonne croissance bactérienne et qui réalise un compromis pour l'activité des antibiotiques).
L'épaisseur de la gélose va donc conditionner la concentration de la source d'antibiotique et elle doit être de 4 mm.
Les antibiotiques, ainsi que les disques doivent être standardisés. Cette standardisation est effectuée par les fabricants et le laboratoire a pour unique responsabilité de stocker les disques dans des conditions optimales et de ne pas utiliser des disques périmés. Avant utilisation, les disques doivent être amenés à température ambiante. Toute cartouche ouverte doit être utilisée dans les cinq jours.
La densité de l'inoculum bactérien est un élément primordial et elle doit être ajustée à l'aide d'un photomètre ou par comparaison avec un étalon d'opacité (échelle de McFarland).
Une phase de pré-diffusion des antibiotiques peut conduire à l'obtention de zones d'inhibition plus importantes. Selon les pays, une pré-diffusion est ou non préconisée. En France, la technique du "Comité de l'Antibiogramme de la SFM" ne prévoit pas de pré- diffusion
La température et la durée d'incubation doivent être fixes. Pour la majorité des bactéries l'incubation est effectuée à 35-37 °C durant 18-24 heures dans une atmosphère normale
La technique doit être régulièrement contrôlée avec des souches de référence
- DIF Guendouz: dif guendouz