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TP N° 9 :ISOLEMENT DE LA FLORE TOTALE DU SOL (DENOMBREMENT)

I- Objectifs 

 Isoler et dénombrer des microorganismes qui se trouvent dans un échantillon de sol par la méthode des dilutions tout en maintenant le plan de travail aseptique.

 

II- Echantillonage

Afin de déterminer la flore présente dans le sol, nous allons prélever de façon le plus stérilementpossible, un échantillon de terre afin de limiter l’apport d’autres contaminants.

 

 

III- Matériel utilisés

Boites de pétri contenant le milieu gélose nutritive

Tubes à essayecontenet

Micropipette de 1 ml

Embouts bleus et jaunes stériles

Pipettes Pasteur (râteau)

Portoir pour tubes.

Balance de précision

Etuve

 

IV- Protocole expérimentale

1 g de sol est pesé puis introduit dans un tube à essai contenant 9 ml de l'eau physiologique préalablement autoclavée. Le tube est ensuite agité énergiquement pendant 2 minutes. Le contenu du tube représente la solution mère.

Une série de dilution variant de 10^-1 à 10^-9est préparée. Le dénombrement après culture concerneévidement les cellules viables de l'échantillon.

Un volume de 0,1 ml est prélevé  à l’aide d’une micropipette avec un embout stérile, puis déposé au centre de la gélose préalablement fondu est réparti dans des boites. Ce volume étalé à l’aide d’une pipette râteau sur toute la surface de gélose. Les boites de pétri sont mises dans l’étuve à 30 °C.

Après 24h à 48h d'incubation à 30°C, les colonies développées sont dénombrées à l'aide d'un compteur de colonies.

 

V- Dénombrement

il faut considérer que chaque colonieou clone visible correspond à un microorganisme déposé sur la boîte lors de l’étalement. Vue quecertaines colonies provenant de plusieurs cellules juxtaposées ou a partir des spores, on ne peut considérer que chaque cloneprovient d’une seule cellule originelle. On utilise donc le terme d’UFC (unité formant colonie) pourrapporter le résultat obtenu.

 

Le nombre de germes par gramme de sol est déterminé en calculant la moyenne arithmétique et en tenant compte des facteurs de dilution, selon la formule

 

N = n / d . v

 

N : nombre des microorganismes en UFC/ ml.

n: nombre des colonies dénombrées. seules les boîtescontenantentre 30et 300colonies serontprises en comptes

v: Volume prélevé (0.1ml).

d: Dilution.